人體解剖學(xué)：結(jié)締組織到底該怎么染色?結(jié)締組織的染色方法有哪些？
結(jié)締組織在人體內(nèi)分布很廣泛,由它發(fā)生的腫瘤和瘤樣病變與其它某些組織來源的腫瘸難以鑒別,如纖維瘤,帶狀瘤,平滑肌瘤和神經(jīng)纖維瘤相似,用一般染色難以鑒別。所以,須要用特殊染色法來鑒別,才能作出正確的病理診斷。結(jié)締組織的染色方法有哪些？
以下文章來源于聊點學(xué)術(shù) ，作者Mark
結(jié)締組織染色概述
組織學(xué)上，結(jié)締組織分為3種，包括致密結(jié)締組織、疏松結(jié)締組織以及網(wǎng)狀結(jié)締組織。而結(jié)締組織染色法可以很好的顯示出各種纖維，如膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈力纖維，以此展現(xiàn)各種組織病變或修復(fù)情況。結(jié)締組織染色最經(jīng)典的方法是Mallory三色法，其它的染色方法基本都是衍生于它。
Q1： 結(jié)締組織三色法染出來到底有啥用？
答：HE無法有效區(qū)分膠原纖維，而三色法可將其標(biāo)記出來，用于病理分析或半定量分析都是可以的。三色法還可以展現(xiàn)各種組織病變或修復(fù)情況，如心肌壞死后纖維修復(fù)情況;還可以對心內(nèi)膜彈力纖維增生和心肌纖維化作鑒別診斷。可以為腫瘤相關(guān)病變提供病理診斷參考。
Q2： 各種染色方法的最佳適用條件？
答：(1)Mallory三色法：網(wǎng)狀纖維、膠原纖維以及堿性物質(zhì)可被染成深藍色，而軟骨、黏液等被染成淺藍色;神經(jīng)膠質(zhì)、纖維素、肌纖維以及酸性物質(zhì)被染成粉紅色;紅細(xì)胞、彈力纖維可被染成橘色;最后細(xì)胞核被染成黑藍色。
一般所說的結(jié)締組織是指纖維性結(jié)締組織而言，其結(jié)構(gòu)特點是細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)基質(zhì)外含有較多的纖維成分，主要是膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維，我們僅簡述這三種纖維的常見染色方法。
Mallory三色染色法：常用于判定多種組織、器官的病變程度及修復(fù)情況，區(qū)分腫瘤組織中的纖維成分與平滑肌。
染色步驟：
①中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。
②重鉻酸鉀液10min。
③蒸餾水沖洗2min，蒸餾水2次。
④酸性復(fù)紅液2min，蒸餾水稍洗。
⑤苯胺藍液20min，95%乙醇快速分化。
⑥直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
結(jié)果判定：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍色。
(2)Van Gieson苦味酸酸性復(fù)紅法：可以顯示組織、器官的損傷、修復(fù)及硬化情況，特別是用于鑒別腫瘤組織中的膠原纖維與平滑肌纖維，可為診斷提供重要依據(jù)。
染色步驟：
①組織切片按常規(guī)脫蠟水洗。
②用Weigert蘇木素液染細(xì)胞核5~l0 min。
③自來水充分洗滌數(shù)分鐘。
④用顯微鏡檢查細(xì)胞核的著色程度，過深可用0.5%鹽酸乙醇分化。
⑤自來水洗至變藍;用蒸餾水洗。
⑥用Van Gieson液染1~5 min。
⑦傾去染液，直接用95%乙醇分化和脫水。
⑧無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
結(jié)果判定： 膠原纖維呈深粉紅色，肌纖維、胞漿及紅細(xì)胞黃色，細(xì)胞核呈棕黑色或蘭黑色。
(2)Cason三色法：是經(jīng)Mallory三色法改良而來的混合型染料染色法，可將酸性物質(zhì)染的更深，且操作相對簡便。
(3)Masson三色法：也是概念而來，較適用于上皮、甲狀腺、腫瘤以及垂體等。
(4)AZAN三色法：除了標(biāo)記結(jié)締組織外，還可將染胰島和腺垂體細(xì)胞染色。
(3)網(wǎng)狀纖維染色-Wider染色法：可以用來顯示病變組織網(wǎng)狀支架的破壞情況。特別是在腫瘤病理診斷中，網(wǎng)狀纖維染色對于鑒別來源于上皮組織和間葉組織的惡性腫瘤具有重要價值。
染色步驟：
①組織切片脫蠟至水。
10%②磷鉬酸，2~5min。蒸餾水沖洗，5min。
1%③硝酸鈾，5s。蒸餾水沖洗，10s。
④氧化銀溶液，5~10min。
95%⑤乙醇速洗，1~2s。
⑥還原液還原，1~2s。蒸餾水沖洗，2min。
0.2%⑦氯化金調(diào)色，2~20s。蒸餾水沖洗，5min。
5%⑧次亞硫酸鈉，2min。蒸餾水沖洗，2min。
⑨核固紅染細(xì)胞核，5~10min。水稍洗。
⑩常規(guī)無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。
結(jié)果判定：網(wǎng)狀纖維呈黑色、細(xì)胞核呈紅色。
Q3： 想要染出好看的顏色，該怎樣選擇固定液？
答：Zenker固定液是首先。因為它的穿透性很強，可以很好地固定每一種組織。固定后的組織染色很清晰。但有溶解染色質(zhì)的缺點。大家可綜合考慮。
Q4： 已經(jīng)用甲醛固定了的組織怎么處理呢？
答：如果組織已經(jīng)在甲醛中固定過，且制作成石蠟切片。沒事，在切片完全脫蠟復(fù)水后，再浸入Zenker固定液中一晚上(室溫就行)，然后流水漂洗，直到切片上的黃色基本消失即可進行染色。
Q5： 想看看椎間盤退變，怎么染色？
答：誠然HE染色也是可選的，但是Mallory三色法可以很好地觀察椎間盤髓核、軟骨終板以及纖維環(huán)的病理改變。那么Mallory三色法則提供了較好的對比度，在分辨力上具有優(yōu)勢。染法沒啥特殊的，就是要記得在固定后脫鈣處理(脫鈣液：5%甲酸+5%鹽酸+75乙醇混合使用，最終PH調(diào)成2。2)。
Q6： 神經(jīng)損傷怎么染色又快又好？
答：常規(guī)HE染色不僅耗時，而且神經(jīng)髓鞘會被溶解。選擇Masson染色可以很好地顯示神經(jīng)髓鞘，比較便宜方便。PS：神經(jīng)組織可用4%甲醛-鈣溶液、Zenker固定液、或者Bouin固定液進行固定，可以有效減少神經(jīng)髓鞘的丟失。Masson染色步驟不細(xì)表。
Q7： 腺體、垂體如何染色比較好看？
答：常規(guī)HE染色，確實能染，但是效果不是很好，染色后組織結(jié)構(gòu)不清晰。上面提到的AZAN三色法除了標(biāo)記出結(jié)締組織外，還可將染胰島和腺垂體等染色。最終效果是腎上腺的球狀帶被標(biāo)記為藍色，毛細(xì)血管呈橘黃色，束狀帶內(nèi)的脂肪也比較清晰。垂體中嗜酸性細(xì)胞呈紅色，嗜堿性細(xì)胞和結(jié)締組織呈藍色，血細(xì)胞則染成橘黃色。這樣看來，整個顏色分辨度還是蠻高的。
Q8： 網(wǎng)狀纖維與免疫組化雙染-兩開花？
答：同一張腫瘤組織切片上同時染出網(wǎng)狀纖維和神經(jīng)膠質(zhì)纖維GFAP、以及波形蛋白。網(wǎng)狀纖維只能被硝酸銀染色，可以選擇用常規(guī)的Gomori染色法。因此整個過程大致要分兩部分。
常規(guī)脫蠟復(fù)水。
第一步是銀染，0。5%高錳酸鉀2min后去離子水漂洗;
1%草酸漂白1min后再去離子水漂洗;
2.5%鐵明礬溶液3min后去離子水漂洗至少2次;氨銀溶液20s后快速漂洗，進入1%甲醛中快速還原，然后水洗(配方：3%的氫氧化鈉10ml+10%的硝酸銀水溶液10ml，+再加幾滴氨水);
0.2%氯化金染成金色后漂洗;最后再用5%的硫代硫酸鈉中還原，漂洗。第二步是免疫組化染色，無需再進行抗原修復(fù)，直接進入3%雙氧水孵育5min，然后水洗;再用PBS平衡5min;
5%血清封閉，室溫下10-15min就行;分貝滴加相應(yīng)的一抗4℃過夜(抗體得選好，滴度可適當(dāng)提高)，PBS漂洗;接著滴加二抗，可37℃半小時，漂洗干凈后進行DAB顯色反應(yīng)。最后水洗干凈，采用免疫組化專用蘇木素染核、分化、反藍、水洗。
最后就是常規(guī)的脫水透明封片了。
PS： 此法整個過程較長，且存在多步氧化、還原及水洗過程，操作要輕柔，不然分分鐘脫片，欲哭無淚。但是理解好這里面每一步，那么你的氨銀染色技術(shù)肯定突飛猛進。事實上，氨銀染色技術(shù)還可以依靠微波、胰蛋白酶以及改變試劑配方等方法加強染色，這就屬于高階了。
Q9： 同時顯示彈力纖維和脂質(zhì)？
答：搞血管脂質(zhì)代謝研究的同志可以試試，大原則就是將油紅O染色(配方：油紅0。2g+70%乙醇400ml充分混勻后靜置，使用時也別晃動)與為維多利亞藍染色相結(jié)合。血管組織要用15%中性甲醛充分固定，再作液氮冷凍冰凍切片，厚度為15微米左右，雙蒸水輕輕漂洗;再在70%乙醇中小心漂洗2次;進入油紅O中染15min，再用70%乙醇洗干凈;在維多利亞藍中染15min左右;在80%乙醇中分化1min;雙蒸水2min小心漂洗后洗去組織周圍多余水，用甘油膠封片。
PS：維多利亞藍染色液如果自己配制，真的很繁瑣。建議直接買商品。另外染色時，一定要漂浮染色，可別貼著玻片染。
Q10： 彈力纖維+免疫組化=再次開花
答：Gomori染色法可以很好地區(qū)分血管內(nèi)、中、外彈力膜，層次很清晰。然后再加上你想要的免疫組化標(biāo)記物。這個跟前面剛好反過來了。先常規(guī)染免疫組化，再作Gomori染色。免疫組化可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整：如選擇特異性強的一抗，縮短一抗孵育時間至1h，這樣就可以在一天內(nèi)完成了，小編就貼公司名字了。然后就是Gomori染色：上一步結(jié)束，切片要漂洗充分并在70%乙醇適當(dāng)漂洗;接著在醛品紅液中染色10-15min左右，用70%乙醇適當(dāng)漂洗直至不再掉色，然后晾干樹膠封片就行。
PS：醛品紅配制法：堿性品紅0。5g+70%乙醇100ml+濃鹽酸1ml+三聚乙醛1ml。堿性品紅溶于70%乙醇混勻后，加濃鹽酸混勻，再加三聚乙醛混勻，室溫靜置2天，待醛品紅溶液成熟變成深紫色，過濾后4℃冰箱保存。
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